對(duì)于做液相色譜分析的人來(lái)說(shuō),我們先接觸到的往往是對(duì)于弱極性或者中等極性化合物的分離。對(duì)于這類化合物的分析來(lái)說(shuō),常用的是C8或者C18的反相色譜柱,而且對(duì)于這類化合物的方法開發(fā)及條件優(yōu)化我們也都比較的熟悉。但是近些年來(lái)越來(lái)越多的人開始關(guān)注對(duì)極性化合物的分析,尤其是隨著對(duì)體內(nèi)代謝物的研究不斷發(fā)展,對(duì)我們分析極性代謝物提出了更多的挑戰(zhàn)。
其實(shí)現(xiàn)在我們很多人也會(huì)采用反相色譜柱來(lái)分析一些極性化合物,比如流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑或者采用一些極性封端的反相柱。當(dāng)然這些比較經(jīng)典的方法對(duì)于很多極性化合物的分析效果都是不錯(cuò)的,但是都會(huì)面臨一些問(wèn)題。
比如,加入離子對(duì)試劑,本身離子對(duì)試劑對(duì)于色譜柱的壽命會(huì)有一定的影響,流動(dòng)相制備也相對(duì)復(fù)雜,另外很多時(shí)候也沒法與質(zhì)譜兼容;采用極性封端類的柱子,流動(dòng)相中會(huì)用到比較高比例的水,壓力會(huì)比較高,而且即使水相比例較高,對(duì)于一些很強(qiáng)極性的物質(zhì),仍然難以得到很好地保留。而HILIC可以克服以上的缺點(diǎn),大大滿足您對(duì)極性化合物的分析要求。
什么是HILIC ?
HILIC是 Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography(親水作用液相色譜)的簡(jiǎn)稱。我們首先要清楚,HILIC不是某個(gè)廠家的色譜柱系列或品牌,也不是某個(gè)鍵合相,它代表的是一種分離機(jī)理,而具備這種分離機(jī)理的鍵合相種類非常多。在HILIC中,固定相是極性的,流動(dòng)相中的水相部分表現(xiàn)為強(qiáng)洗脫溶劑,這與傳統(tǒng)的反相色譜法*相反。
HILIC 發(fā)展歷史
HILIC分離模式早可以追溯到1951年,Gregor等人描述了一種離子交換樹脂表面的富水層概念,在1975年的時(shí)候,科學(xué)家在氨基柱上實(shí)現(xiàn)了糖類的分析也是屬于HILIC的機(jī)理,但是直到1990年科學(xué)家Alpert才正式提出了HILIC的概念,但是這時(shí)候HILIC并沒有得到廣泛的推廣,到了2000年以后,越來(lái)越多的人開始認(rèn)識(shí)并使用HILIC機(jī)理進(jìn)行極性化合物的分析,HILIC才得到了廣泛的認(rèn)可。
HILIC 的作用機(jī)理
HILIC可以被認(rèn)為是反相液相色譜通過(guò)采用極性固定相來(lái)運(yùn)行的。HILIC中采用的流動(dòng)相是含有少量水/緩沖鹽或其他極性溶劑的高比例有機(jī)相(>60%,常用乙腈)。流動(dòng)相中的水形成一個(gè)富水層被吸附在固定相表面,極性物質(zhì)首先進(jìn)入富水層得到保留。極性化合物是通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的混合模式被保留的,包括:富水層和流動(dòng)相之間的親水分配、極性官能團(tuán)和固定相間的氫鍵作用以及離子官能團(tuán)的靜電作用。當(dāng)然,親水分配是主要的保留模式。從保留機(jī)理來(lái)看,HILIC和反相色譜柱是有著非常大的差別的。
HILIC 流動(dòng)相
HILIC常用的流動(dòng)相是乙腈/水系統(tǒng)。比例:有機(jī)溶劑>60%,流動(dòng)相中至少需要3%的水相(因?yàn)镠ILIC保留機(jī)理是通過(guò)形成富水層來(lái)實(shí)現(xiàn)的)。洗脫強(qiáng)度:四氫呋喃<丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇 <甲醇<水。對(duì)于條件摸索來(lái)說(shuō),等度條件下建議80%乙腈為起始條件來(lái)調(diào)整比例;梯度條件建議95%乙腈------60%乙腈。對(duì)于HILIC來(lái)說(shuō),我們有時(shí)也會(huì)在流動(dòng)相中加入緩沖鹽,建議使用甲酸銨/乙酸銨(常用乙酸銨)緩沖液,可以同時(shí)滿足溶解度(醋酸鹽在高比例乙腈中溶解度較好)以及質(zhì)譜檢測(cè)器兼容性的要求。
HILIC 固定相
上面我們提到,HILIC保留機(jī)理的固定相種類非常多。常用的包括:
1,裸硅膠(如賽默飛的Hypersil Silica, SyncronisSilica及Accucore HILIC等),這種固定相在HILIC中也是應(yīng)用廣泛的固定相,未鍵合硅膠由于表面具有硅羥基,具有一定的陽(yáng)離子交換活性,所以可以增強(qiáng)對(duì)堿性化合物的保留。
2,兩性離子固定相(如Syncronis HILIC),此種固定相既有陽(yáng)離子基團(tuán),又有陰離子基團(tuán),二者比例1:1,因此表面靜電荷為零。對(duì)于分析中性極性化合物是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。
3,酰胺鍵合相(如Accocore Amide HILIC),通過(guò)丙基或者專有連接基團(tuán)將酰胺官能團(tuán)鍵合到硅膠表面,此種鍵合相能夠提供固定相和分析物之間的強(qiáng)有力的氫鍵作用,保留能力強(qiáng),對(duì)于碳水化合物分析是一個(gè)不錯(cuò)的選擇,如聚糖的分析。酰胺鍵合相不太容易產(chǎn)生不可逆吸附(氨丙基固定相經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題),同時(shí)酰胺類色譜柱表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。其他的HILIC固定相包括:二醇基、氨丙基(氨基柱)、氰丙基(氰基柱)以及其他專有的特殊官能團(tuán)鍵合相。
HILIC 的優(yōu)勢(shì)及不足
通過(guò)上面我們介紹到的HILIC的機(jī)理及流動(dòng)相和固定相的特征我們不難得出HILIC在分析極性化合物方面的優(yōu)勢(shì)。首先,HILIC機(jī)理對(duì)于幾乎所有的極性化合物都有較好的保留,大大解決了我們分析極性化合物時(shí)遇到的難以保留的問(wèn)題。其次,由于HILIC流動(dòng)相有機(jī)相比例很高,所以對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)器來(lái)說(shuō),可以確保去溶劑化,大大提高化合物的信噪比。另外,較高的有機(jī)相比例組成也會(huì)帶來(lái)更低的色譜柱壓力,在這個(gè)基礎(chǔ)上,我們采用小粒徑或者小內(nèi)經(jīng)的色譜柱時(shí)就不會(huì)受到壓力的困擾。
HILIC的優(yōu)勢(shì)是很明顯的,但是對(duì)于任何一種分離手段,也都存在一些不足之處。由于HILIC保留機(jī)理比較復(fù)雜,所以在方法優(yōu)化及色譜柱選擇上會(huì)比普通反相色譜柱要復(fù)雜。HILIC保留機(jī)理由于需要形成富水層,所以色譜柱平衡時(shí)間會(huì)稍長(zhǎng),建議是普通反相的2-3倍,當(dāng)然,這個(gè)問(wèn)題其實(shí)在反相采用離子對(duì)試劑分析的時(shí)候也會(huì)碰到。另外,由于極性化合物在水中的溶解性好,但是如果我們采用純水相來(lái)溶劑樣品的話,有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)溶劑效應(yīng)帶來(lái)的色譜峰展寬,就如同我們反相分析時(shí)用純有機(jī)相溶解樣品有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)類似的問(wèn)題。所以,建議采用純有機(jī)相或者與流動(dòng)相比例接近的溶劑來(lái)溶解樣品。
通過(guò)以上關(guān)于HILIC的介紹,相信大家對(duì)HILIC有了更進(jìn)一步的了解。在以后我們分析極性化合物方面又多了一個(gè)更有力的工具!
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